T7 RNA聚合酶

T7 RNA聚合酶

1. 產(chǎn)品描述

作為生物大分子,mRNA 只能通過(guò)體外轉錄(IVT,in vitro transcription)的方法大規模合成,T7 啟動(dòng)子是目前轉錄效率***的啟動(dòng)子之一,因此采用 T7 RNA 聚合酶(T7 RNA Polymerase)進(jìn)行體外轉錄可獲得更多的合成產(chǎn)物。本制品 T7 RNA PolymeraseT7 RNA 聚合酶)為噬菌體 T7 DNA 編碼的酶,是一種高度特異識別 T7 啟動(dòng)子序列的 DNA 依賴(lài)的 5'→3' RNA 聚合酶,以含有 T7 啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈 DNA 為模板,以 NTP 為底物,合成與 DNA 中一條鏈互補的 RNA。T7 RNA 聚合酶是體外轉錄生產(chǎn)治療用 mRNA 的關(guān)鍵酶。本品為利用大腸桿菌大規模發(fā)酵表達的 GMP 級重組 T7 RNA 聚合酶,采用藥用規格原輔料生產(chǎn),并嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等,符合GMP 規范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規程保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。

2. 質(zhì)量要求

項目

標準

外觀(guān)

應為澄明液體

可見(jiàn)異物

不超過(guò)3個(gè)/

裝量

不低于4mL/

鑒別(SDS-Page

應與參比品條帶一致

蛋白濃度(RP外標法)

應為標識濃度的±10%

pH

7.9±0.5

細菌內毒素

10EU/mL

非特異性核酸酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

核酸內切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

核酸外切酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

RNA酶殘留

瓊脂糖電泳凝膠顯示應為陰性

HCP殘留

50ng/ mg

HCD殘留

100pg/ mg

鎳鹽殘留

10ppm

重金屬殘留

10ppm

純度(SEC-HPLC

95.0%

純度(RP-HPLC

95.0%

活性

應不低于50KU/mL;

微生物限度

應不高于1CFU/1mL

3. 遵循生產(chǎn)規范

1-《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)品》***藥品監督管理局。
2-《人用基因治療總論-中國藥典2020》***藥典委。
3- USP Chapter , Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
4- USP Chapter , Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中細胞因子和生長(cháng)因子。
5- Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細胞或基因治療藥物的生物來(lái)源原料。

4. 產(chǎn)品基本信息

來(lái)源

攜帶噬菌體 T7 DNA 基因的 E. coli

儲存緩沖液

50 mM Tris-HCl (pH 7.9);100 mM NaCl;10mM DTT;1 mM EDTA;0.1% Triton X-100;50% (v/v) Glycerol

儲存條件

-20±5

5. 產(chǎn)品特點(diǎn)

5.1更好的酶活

通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù),對 T7 啟動(dòng)子有高度特異性。相同完整率下,遠高于市售主流競品的產(chǎn)率。

RNA生成量(μg

時(shí)間(min

KK市售產(chǎn)品

樂(lè )布斯產(chǎn)品

180

64.8

97.8

150

65.3

95.1

120

59

93.6

90

57.1

91.1

60

55.5

86.7

30

43.6

67.4

10

24.9

61.6

KK競品對比測試,在3h反應時(shí)間下產(chǎn)量提升50.9%

樣品名稱(chēng)

濃度μg/μL

A260/A280

A260/A230

***終mRNA溶液體積

IVT反應體系

折算產(chǎn)率

樂(lè )布斯產(chǎn)品 200U/μl

1783.9

1.97

2.16

0.5mL

100μL

8.92mg/mL

ZW市售產(chǎn)品 200U/μl

1400.3

1.94

2.14

0.5mL

100μL

7.00mg/mL

ZW競品對比測試,在3h反應時(shí)間下產(chǎn)量提升27.4%

5.2.更好的 凍融穩定性

37 24h、凍融5次條件下,樣品穩定。

5.3.完善嚴苛的質(zhì)量標準

 

獨立的SEC-HPLC分析方法開(kāi)發(fā) RP-HPLC 分析方法開(kāi)發(fā)

6. 產(chǎn)品用途

1- 合成單鏈 RNA,用于 mRNA 疫苗等制備。

2- 合成高特異性 RNA 探針。

3- 合成 siRNA 前體。

4- 制作 RNA 剪接反應(RNA splicing)的前體。

5- 利用帽類(lèi)似物合成帶帽 RNA

7. 產(chǎn)品包裝

1- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (50U/μl)。

2- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (200U/μl)。

3- T7 RNA Polymerase, GMP Grade (可定制規格)。

8. 注意事項

1- 模板效率和孵化時(shí)間: 不同模板的產(chǎn)量會(huì )因模板的序列、結構、長(cháng)度、純度以及特定 RNA 聚合酶啟動(dòng)子的序列和長(cháng)度而有所不同。影響轉錄產(chǎn)量的污染物包括核糖核酸酶或污染物,如苯酚、微量金屬和 SDS。

2- 優(yōu)化的反應推薦的反應條件可適用于大多數模板的體外轉錄,但是,對于某些模板,可以通過(guò)延長(cháng)反應時(shí)間(4 小時(shí)-過(guò)夜反應), 增加模板的用量來(lái)提高產(chǎn)率。

3- 保持 RNase-free 環(huán)境:使用無(wú) RNase 管和移液槍?zhuān)惶幚砗?span style=";padding: 0px;border: 0px;list-style: none"> RNA 的試劑盒組件或樣品時(shí)應戴手套,并經(jīng)常更換手套,特別是接觸到 RNase 的潛在污染源,如門(mén)把手、 鋼筆、鉛筆和人體皮膚后。不使用時(shí),應將所有試劑密封好。在孵育過(guò)程中,將所有含有 RNA 的試管密封。

4- 在配置反應體系時(shí),可以加入 適當的RNase 抑制劑。

5- 由于配套 Transcription Buffer 內的成分濃度偏高,高鹽環(huán)境會(huì )導致聚合酶失活,同時(shí) buffer 中含其它多種成分物質(zhì),可能會(huì )與模板 DNA 形成沉淀,配制反應液時(shí)需調整組分加樣順序,計算好體系,先加水,然后加 Buffer,NTP,***加模板和酶,以防止反應buffer中的高濃度鹽離子對酶造成影響。

9. 模板制備

帶有雙鏈 T7 啟動(dòng)子的線(xiàn)性化質(zhì)粒、PCR 產(chǎn)物或者合成的 DNA 片段都可以作為 T7 RNA Polymerase 體外轉錄模板,模板可用TE 緩沖液或 RNase-free Water 溶解。

1- 質(zhì)粒模板(建議每個(gè)反應加 1μg 線(xiàn)性化質(zhì)粒作為模板)帶 T7 啟動(dòng)子的質(zhì)??梢宰鳛檗D錄模板,質(zhì)粒的線(xiàn)性化和純度會(huì )影響轉錄的產(chǎn)量及 RNA 的完整性。環(huán)狀質(zhì)粒由于沒(méi)有有效的終止,會(huì )轉錄出不同長(cháng)度的 RNA 產(chǎn)物,為了得到特定長(cháng)度的 RNA,質(zhì)粒必須完全線(xiàn)性化,線(xiàn)性化的質(zhì)粒請確保雙鏈為平末端或編碼鏈 5‘端為突出結構。

2- PCR 產(chǎn)物模板(建議每個(gè)反應加 0.1μg~1μg 作為模板)  T7 啟動(dòng)子的 PCR 產(chǎn)物可以作為體外轉錄模板。PCR 擴增模板時(shí)將 T7 啟動(dòng)子加在有義鏈的上游引物的 5’端。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后作為模板。

3- 合成的 DNA 模板(建議每個(gè)反應加 0.1μg~0.5μg 作為模板) 合成的帶有 T7 啟動(dòng)子的 DNA 片段也可以作為體外轉錄的模板。

10. 體外轉錄實(shí)驗流程

1- 將各組分融化后分別混勻,短暫離心收集于管底,冰上儲存備用。

2- 加入以下各組分:

組分

加入量

Transcription Buffer

2 ul

ATP/GTP/CTP/UTP Mix

Each 2mM

Template DNA

20ng-1μg

T7 RNA Polymerase

50 U

RNase Free Wate

Up to 20 ul

注:根據實(shí)際情況可以在反應體系中可添加 RNase Inhibitor  1U/μl,防止實(shí)驗過(guò)程環(huán)境中RNase 污染。模板 DNA 應為 RNaseA-Free、高純度,建議 OD260/280  1.8~2.0。

3- 用移液器輕輕混勻各組分,并短暫離心收集,37℃孵育 2-3 h。 為避免蒸發(fā)對反應體系的影響,建議在 PCR 儀中進(jìn)行反應??筛鶕a(chǎn)物片段大小適當的調整反應時(shí)間,如合成小于 0.3 kb  RNA,可將反應延長(cháng)至 4 h 或更長(cháng)時(shí)間,16 h 過(guò)夜反應不會(huì )影響產(chǎn)物的質(zhì)量。

4- 在反應體系中加入 1μl  DNase I ,37℃孵育 15 min,消化轉錄的 DNA 模板。相對于產(chǎn)物 RNA,模板 DNA 的含量非常低,一般不用去除,也可以用 DNase I 消化。

5- 合成的 RNA 經(jīng)電泳分析、純化后,可用于下游實(shí)驗。產(chǎn)物濃度極高,需用 RNase-free Water 稀釋后再檢測。



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